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            超薄切片厚度和干涉色

            更新時間:2023-11-21  |  點擊率:378
            通常會向超顯微術的學生介紹大家周知的“Peachey圖”。該圖顯示了切片厚度與它們在刀槽中漂浮時觀察到的干涉色之間的關系,并被超微切片機的漫射白光照亮(Peachey,1958)。自從他的第一篇文章以來,早期的超微計制造商之一lvan Sorvall,lnc.制作了干涉色與切片厚度的圖表,該圖表被其他商業公司復制,并在電子微鏡實驗室中變得非常普遍。然而,這張圖表是藝術家對Peachey的原始數據的再現,并沒有準確地描繪出現代超微光度計改進的照明和設計所看到的顏色。因此,RMC Boeckeler進行了一項簡單的研究,以顯示干涉色,觀察并拍攝了嵌入常用環氧樹脂中的典型生物標本。

             


             


            使用儀器
            本研究使用了The RMC Boeckeler PowerTome。它配備了一個機械推進系統,該系統具有一個高重復性切割臂推進的精密數字線性標尺。這款先進的超高倍顯微鏡還配有觸摸屏電腦和帶高清攝像頭的三目立體顯微鏡,用于拍攝切片時的圖片和視頻。該成像系統還有一個測量工具,可用于測量切片尺寸和面積,以便與樣品塊表面的尺寸和面積進行比較,從而估算切片壓縮量。
            程序
            將小鼠脾臟固定在4%甲醛和1%戊二醛中,并后包埋在來自電子顯微鏡科學公司(EMS,哈特菲爾德,賓夕法尼亞州,美國)的Embed 812樹脂中。這是一種常用的EPON812替代樹脂,是許多實驗室中用于生物標本的環氧樹脂混合物的代表。按照制造商的說明,使用硬混合物。使用生產PT PCZ超薄切片機進行切片。使用Mitutoyo千分尺(型號#ID-C112E),通過獨立的方法驗證切割臂的機械前進,該測微計(千分尺)可以讀取1um增量的線性距離。使用儀器控制器使切片臂前進10 um,并將這些距離與Mitutoyo千分尺在切割臂整個200um前進范圍內的讀數進行比較。這兩個讀數在1%的誤差范圍以內。切割臂的機械推進是通過步進電機和數字線性推(前)進系統的反饋控制來實現的,因此,超薄切片的較小推進預計也同樣準確。例如,100納米步進多個累加增量導致在Mitutoyo千分計上的讀數與1微米和10微米的較大進階相同。
            在30nm至400nm范圍內切割切片,并在切片時和在CHCI3蒸汽”拉伸”(減壓)后拍照。設置相機的增益和曝光設置,使得生成的圖像與通過立體顯微鏡直接觀察到的顏色和亮度緊密匹配。使用圖像處理軟件lmageJ(NIH,USA)排列切片圖像,以產生圖2。

            結果
            RMC Boeckeler PowerTome PCZ穩定而精確的先進系統是切片典型環氧樹脂包埋標本以記錄切片干涉色的*佳選擇。厚度在70納米和100納米之間的切片的金色的細微變化很容易區分。在170納米附近可以看到明亮的藍色,比Peachey最初在舊儀器上報告的190納米到240納米要薄得多。
            圖2顯示了CHCla”拉伸“的切片截面,這是許多實驗室的準技術。其他人經常使用一種裝置,使加熱的絲經過該部分,以獲得該部分的類似減壓。切片的解壓縮有利于改善切片在透射電子顯微鏡(TEM)的光束內拉伸和移動的效果。我們發現,與樣品塊面相比,截面長度壓縮了大約10%。在CHClg拉伸后,壓縮減少到約8%。因此,這些部分的實際厚度可以等效地減小。圖2是由一臺儀器制作的實際切片構建而成,該儀器被證實是精確的,為超微切片師提供了更精確和更新的參考,因此比以前由藝術家制作和商業發行的圖表更有用。此圖表還涵蓋了更大的厚度范圍,展示了一些干涉色如何隨著切片厚度的增加而重復出現。
            參考Peachey,L.D.(1958)J.Biophys。生物化學Cytol.4,233.
            Sjo strand,F.S.(1967)細胞和組織的電子顯微鏡 Electron Microscopy of Cells andTissues281-287。
             
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